用 AI 與共軛焦技術突破類器官成像瓶頸

近年來，人工智慧（AI）與影像處理技術的突破，讓使用者能以簡單操作快速取得高品質的 3D 影像。雖然螢光顯微鏡（epi-fluorescence microscopy）具備在短時間內獲取大量影像的優勢，但由於樣品較厚時會出現模糊的非焦距面螢光訊號，導致對比度下降。透過 3D 去卷積（3D deconvolution）運算可以有效降低這些模糊光，顯著提升影像品質。此外，延伸景深功能（Extended Depth of Focus, EDF）能將 3D 資料合成聚焦清晰、高對比的 2D 影像。本文將介紹如何應用 AI 與影像處理技術，快速取得類器官（organoids）的 3D 影像。

圖1：去除模糊光與提升螢光影像品質

（3D 去卷積與延伸景深，EDF）

(A) EDF 的概念示意圖。

(B) (C) 螢光標記 E-cadherin（Alexa Fluor 594）的腸類器官（三維小腸上皮細胞培養系統）影像，(B) 為 3D 去卷積前，(C) 為 3D 去卷積後。由於 (B) 中存在離焦光，導致對比度降低；而 (C) 中模糊光被有效去除，E-cadherin 的網狀結構得以清晰呈現。

(D) 將經過 3D 去卷積的 39 層 Z-stack 影像合成為單張延伸景深（EDF）影像，並合併顯示細胞核（藍色：DAPI）與 E-cadherin（橘色：Alexa Fluor 594）螢光通道。

(E) 為 (D) 中紅框區域的放大圖。

(F) 為 (E) 中分離出來的 E-cadherin 螢光通道影像。

比例尺：100 μm (D)、25 μm (E)(F) 。

【影像擷取條件】

• 成像方式：螢光（Epi-fluorescence）

• 物鏡：PLAN APO λD 20x（數值孔徑 NA 0.8）

• Z-stack：每層 0.8 μm，共 39 層（Z 軸總範圍：30.40 μm）

高效整合螢光與共軛焦成像的工作流程 

Autosignal.ai 是一套利用 AI 技術自動判斷樣品最適曝光條件的系統，只需一鍵即可完成影像設定。使用螢光顯微鏡可快速找出感興趣區域，再切換至共軛焦顯微鏡，即可獲得解析度更高的 3D 影像，有助於深入理解樣品的三維結構。

Experiment 1：利用 3D 去卷積與 EDF 進行螢光成像

本實驗在 18 秒內使用兩種螢光波長取得 39 層 Z-stack 影像。從「樣品導覽」（Sample Navigation）功能獲取整片玻片影像、精準定位樣品、取得約 30 μm 厚度的類器官影像、直至影像處理完成，整體流程僅約 3 分 30 秒。這種快速的成像流程，能有效提升類器官樣品的高通量影像獲取效率與清晰度。

使用「樣品導覽」（Sample Navigation）的影像流程：

Step 1：「Sample Navigation」功能可拍攝整張玻片範圍，協助快速定位樣本位置。

Step 2：先使用 4X 物鏡尋找目標類器官，再切換至 20X 物鏡，透過「ND Acquisition」功能擷取 Z-stack 影像。

Step 3：對 Z-stack 影像進行 3D 去卷積處理以減少模糊光，接著利用 EDF（延伸景深）功能建立單張全聚焦影像。

這是一套適用於類器官成像與高解析三維影像分析的 AI 自動化工作流程。

影像擷取與處理總耗時：共 1 分 38 秒

• 影像擷取時間：18 秒（放大倍率：20X，Z-stack：每層 0.8 μm × 39 層，Z 軸範圍：30.40 μm）

• 影像處理時間：1 分 20 秒（使用 Richardson-Lucy 演算法進行 3D 去卷積：52 秒，EDF（延伸景深）處理：28 秒）

＊處理平台：NVIDIA Quadro RTX 4500 GPU

Experiment 2：採用高倍數物鏡與 2D 去卷積進行螢光成像

圖2：使用螢光成像與 2D 去卷積技術觀察帶有 crypt domains 的腸類器官（enteroids）

(A) 腸類器官的明視野影像，物鏡：PLAN APO λD 4x（NA 0.2）。

(B) 帶有 crypt domains 的腸類器官明視野影像，物鏡：PLAN APO λD 40x（NA 0.95）。

(C) 經 2D 去卷積處理後的多色螢光疊圖影像（細胞核：藍色，DAPI；E-cadherin：橘色，Alexa Fluor 594）。

(D) 來自影像 (C) 的 E-cadherin 單通道螢光影像。使用高數值孔徑的 PLAN APO λD 40x（NA 0.95）物鏡所拍攝的影像具有較淺的焦深，因此只能觀察樣品體積中較薄的一層。對此影像進行 2D 去卷積處理後，可更清晰地觀察 crypt domains （詳見 D 圖中紅色虛線框處）。

比例尺：1000 μm (A)，20 μm (B) (C) (D) 。

Experiment 3：使用高倍數矽油物鏡進行共軛焦成像

在未經組織透明化處理的腸道類器官深層區域中，光線容易被吸收，影像亮度下降。Denoise.ai 是一套以 AI 為基礎的影像降噪功能，能利用已訓練好的神經網絡模型，從共振掃描共軛焦影像中去除 shot noise（散粒噪聲），以提升影像品質。當將 Denoise.ai 應用於高速共振掃描器所取得的影像時，不僅成功移除了雜訊，甚至在黑暗、深層區域也能大幅改善影像品質（詳見圖3，D1、D2），讓我們得以清晰觀察 crypt domains 中 Paneth 細胞周圍的結構。

圖3：使用 Denoise.ai 提升含 crypt domains 的腸類器官共軛焦影像成像品質

(A) (B) 經螢光染色的腸類器官共軛焦影像，其中細胞核（藍色：DAPI）、E-cadherin（橘色：Alexa Fluor 594）。

比例尺：20 μm（B）

(A) 腸類器官的三維體積重建影像，由227張影像組成（Z軸範圍：53.30 μm）。

(B) 在 Z=123 處的光學切片影像（Z深度：28.77 μm）。

(C) (D) B圖中紅色虛線框選區域的放大影像。

(C1, C2) 應用 Denoise.ai 前的原始影像。

(D1, D2) 應用 Denoise.ai 後的處理影像。

(C1, D1) 細胞核（DAPI）的共軛焦影像。

(C2, D2) E-cadherin（Alexa Fluor 594）的共軛焦影像。

【影像擷取條件】

• 物鏡：Plan Apo Lambda S 60XC 矽油浸物鏡（NA 1.3）

• 縮放倍率：1.3x

• 掃描方式：共振式掃描器

• 影像解析度：2K x 2K 像素

• 平均取樣：4 次

• Z 軸範圍：53.30 μm（Z-stack：每層 0.236 μm，共 227 層）

AI 優勢

1. 操作簡便：自動化影像擷取與處理流程，使取得清晰影像變得更容易。

2. 結合影像處理技術的螢光顯微鏡優勢

• 快速影像擷取：透過影像系統進行拍攝，以高幀率取得影像，能迅速識別感興趣區域。

• 去除模糊光以提升影像品質：2D / 3D 去卷積技術可移除非焦距面螢光訊號，提供細節更銳利的影像。

3. 共軛焦顯微鏡與影像處理的優勢

• 取得 3D 影像：可於三度空間影像中進行光學切片觀察，幫助深入理解三維結構。

• 適用於厚樣品：共軛焦顯微鏡能有效去除離焦光，提供高解析度且清晰的影像。

• 降噪處理：Denoise.ai 能去除 shot noise，改善快速掃描或低亮度樣品的成像品質。

4. 結合螢光與共軛焦影像的優勢

高效率識別感興趣區域：可快速擷取螢光成像影像，快速辨識目標區域，再利用共軛焦顯微鏡擷取 3D 影像並觀察細節。整合這兩種成像方式，有助於縮短從區域篩選到精細觀察的整體流程時間，提升研究效率。